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    重疊PCR
     
     
    重疊PCR的應用是非常廣泛的,他的原理其實很簡單:比如說有兩個基因或者說一個啟動子和一個基因,你要將他們連接到一起,我們首先想到的方法當然是借助于酶切的方法,但有時我們并不一定能構找到合適的酶切位點,或者說我們找到了酶切位點,但這種酶非常特殊或者又很貴,我們可能只用一次,這樣購買酶就變成了一種浪費,難道沒有別的辦法了嗎?當然有,那就是重組PCR技術。舉個例子可能更容易說明。比如兩個基因,一個命名為A,一個命名為B。
    A的序列為5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3,
    B的序列為5- atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。
    首先我們要設計引物,假設引物的序列為:
    A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 
    A2:5-ggggggctagctactagcatgatcagggggtagtcagcgt-3
    B1:5-acgctgactaccccctgatcatgctagtagctagcccccc-3
    B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3
     
    我們的目的是將基因A,B通過PCR的方法連接起來,我們可以仔細的觀察上面的引物A2和B1,我們會發現這兩條引物要比另外兩條引物長很多,為什么會這樣呢?這就是我們在設計引物的時候在A2的3端加入了20個B基因5端的序列,在B1的5端加入了20個A基因3端的序列。我們來看重疊PCR的步驟:
    1.  以A1,A2擴增A基因,B1,B2擴增B基因
    2.  回收A,B基因
    3.  以A,B為共同的模板,A1和B2為引物,擴增A+B,這樣我們就利用重組PCR的方法將A+B拼接起來了。為什么會擴出A+B呢?因為我們
         在設計引物的時候使A,B有了20個互補的堿基,他們可以經過退火結合在一起,因此可以擴增出A+B。
     
    第三步目前很多人的做法都不同,有的人是先加入模板A,B,dNTP,Buffer,水,然后進行3-5個循環的擴增,然后在加入引物A1和B2以及TAQ 酶,這樣做的好處是可以得到特異的擴增,缺點是麻煩。另外一種方法是將引物,雙模板,酶,dntp等所有的反應成分均一起加入PCR管,進行反應,好處是節省時間,不太麻煩。
     
    目前重疊PCR的應用十分廣泛,比如說在基因的定點突變,雖然說現在有很多的突變試劑盒,應用起來也很簡單,但那是需要銀子的;人工合成基因,其實人工合成基因最基本的技術(目前應用最為廣泛的)就是利用重疊PCR的方法;啟動子與目的基因的串連;兩個不同表達盒的連接,大家都知道我們在使用DNA調取或者說擴增基因的時候,往往需要將幾個表達盒串連起來觀察他們的表達效果,但由于絕大多數的DNA中都含有內含子,也就是說幾個外顯子并不是串連在一起的,而要想達到我們的目的,只要應用重疊PCR技術就可以輕松完成。
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