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    DNA濃度和純度的測定
     
     
    可以有兩種方法:分光光度法 溴化乙錠法分光光度法
     
    一、目的
    熟練掌握分光光度法檢測DNA純度和濃度的方法。
     
    二、原理
    DNA或RNA鏈上堿基的苯環結構在紫光區具有較強吸收,其吸收峰在260nm處。波長為260nm時,DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關,也隨構型而有差異。對標準樣品來說,濃度為1μg/ml時,DNA鈉鹽的OD260=0.02當OD260=1時, dsDNA濃度約為50μg/ml ssDNA濃度約為37μg/ml RNA濃度約為40μg/ml 寡核苷酸濃度約為30μg/ml(由于底物不同有差異)當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子污染物時,會影響DNA吸光度的準確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230,計算其比值來衡量樣品的純度。

    經驗值:
    純DNA:OD260/OD280≈1.8 (>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白質、酚等污染)
    純RNA:1.7<OD260/OD280<2.0(<1.7時表明有蛋白質或酚污染;>2.0時表明可能有異硫氰酸殘存)若樣品不純,則比值發生變化,此時無法用分光光度法對核酸進行定量,可使用方案二的方法或其他方法進行估算。
     
    DNA 純度及濃度檢測分光光度法
    定量測定DNA或RNA,應選260nm、230nm、 280nm和310nm波長讀數。其中260nm讀數用來估算樣品中核酸濃度,310nm為背景吸收值。1個OD260值相當于40μg/mLRNA。樣品濃度(μg/mL)=[OD260-OD310]×稀釋倍數×40OD260/OD280的比值用于估計核酸的純度,OD260/OD230估計去鹽的程度。對于RNA純制品,其OD260/OD280≈2.0,OD260/OD230應大于2。OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2說明去鹽不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。
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